人类胚胎干细胞（hESC）在再生医学中应用前景广阔，但长期体外培养会累积拷贝数变异（CNV）和单核苷酸变异（SNV），影响细胞功能甚至带来致瘤风险。这些变异为何总在特定基因组区域反复出现？近日，中国科学院昆明动物研究所遗传进化与动物模型全国重点实验室郑萍团队与浙江大学医学院应颂敏团队合作，首次绘制了hESC高分辨率早期复制脆性位点（ERFS）图谱，为此提供了重要线索。这些反复出现的变异区域，与基因组上一种被称为早期复制脆性位点（ERFS）的结构存在显著关联。相关成果以Early replication fragile sites are associated with cancer-related CNVs and SNVs in human embryonic stem cells为题，于近日发表于国际干细胞期刊Stem Cell Reports。

基因组脆性位点可分为两大类型，其中普通脆性位点（CFS）多富集于超大基因与AT富集区域，而早期复制脆性位点（ERFS）则定位于GC含量偏高、转录活性旺盛的基因密集区域。已有研究证实，人胚胎干细胞（hESC）的基因突变模式与体细胞存在显著差异。hESC的有丝分裂异常发生率极低，且长期体外培养过程中，其反复发生突变的基因大多不属于CFS偏好的超大基因范畴，据此可推测，ERFS可能是介导hESC基因组不稳定性的主要核心元件。但由于hESC对常规细胞周期同步化药物高度敏感，处理后极易发生细胞分化或凋亡，导致始终无法成功构建hESC的ERFS图谱，成为该领域的技术瓶颈。

为突破这一技术难题，本研究团队建立了“两步法”细胞周期同步化策略。第一步，采用低剂量药物组合处理hESC，将细胞精准同步至M期，随后解除药物抑制，使细胞顺利进入G1期；第二步，利用羟基脲（HU）施加DNA复制压力，将细胞同步至S期早期，同时诱发DNA损伤，以此明确早期复制位点的DNA损伤与基因组常见变异的关联性。在此同步化体系基础上，研究团队利用EdU可特异性掺入新生DNA链的特性，对细胞早期复制位点进行精准标记。结合CUT&Tag技术，系统分析早期复制停滞过程中特征蛋白（RPA、BRCA1、SMC5）与DNA损伤蛋白（γH2AX）的共定位特征，最终精准鉴定出hESC的ERFS位点。本研究在H9、TJ-1#两种hESC品系中，分别筛选获得2404个、1438个高置信度ERFS位点。这些ERFS呈现鲜明的特征规律。它们富含GC序列和SINE元件，近70%位于基因启动子内，约30%与已验证的活性增强子重叠，关联基因高度富集于多能性维持、增殖调控和DNA损伤应答等关键通路。简言之，hESC核心功能的调控中枢恰恰也是早期复制中最易断裂的脆弱地带。

那么，ERFS是否与培养中积累的遗传变异有关？团队分析第59代H9细胞全基因组测序数据发现，ERFS热点区域与拷贝数增加事件显著关联，涵盖20q11.21等在hESC长期培养中高频出现的CNV位点及多个癌相关基因；同时ERFS区域的SNV频率也显著更高，突变特征展现出与某些癌症基因组的相似模式。在形成特征方面，ERFS区域普遍呈现低DNA甲基化、高转录活跃组蛋白修饰和高染色质可及性，且倾向于位于反向或相向转录的基因对之间，而基因大小与随机对照区域并无差异——这与CFS对超大基因的偏好截然不同，提示开放的染色质环境及其伴随的转录活动与ERFS形成密切相关（图1）。

该研究提供了首个hESC的ERFS精细图谱，从基因组结构角度为理解培养中遗传变异的选择性积累提供了新框架，有望为优化培养条件、从源头降低遗传异常风险提供指导。

昆明动物所博士研究生董玉萍、浙江大学医学院博士研究生裘梦琳及博士研究生唐浩宇为论文共同第一作者，昆明动物研究所副研究员王林、研究员郑萍和浙江大学医学院教授应颂敏为共同通讯作者。该研究得到国家重点研发计划（2021YFA1102000）、国家自然科学基金（32400664）、云南省基础研究计划（202301AS070062、202401AW070009）、云南省兴滇英才支持计划青年人才项目、中国科学院“西部之光”人才培养计划等项目的资助。

图1. 人胚胎干细胞ERFS的特征及与遗传变异的关联。 ERFS富集于GC序列与SINE元件，多位于开放染色质区；该位点与hESC培养过程中产生的CNV、SNV显著相关，且和肿瘤相关变异存在联系。

文章链接：https://doi.org/10.1016/j.stemcr.2026.102968